免疫組化技術(shù)常見問題

1、一抗的選擇要點(diǎn)和技巧是什么？

（1）單克隆和多克隆抗體的選擇。由一種克隆產(chǎn)生的特異性抗體叫做單克隆抗體。單克隆抗體能目標(biāo)明確地與單一的特異抗原決定簇結(jié)合。另一方面，即使是同一個(gè)抗原決定簇，在機(jī)體內(nèi)也可以由好幾種克隆來產(chǎn)生抗體，形成好幾種單克隆抗體混雜物，稱為多克隆抗體。在抗原抗體反應(yīng)中，一般單克隆抗體特異性強(qiáng)，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對就低；而多克隆抗體特異性稍弱，但抗體的親和力強(qiáng)，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色（可以通過封閉等避免）。

（2）應(yīng)用范圍的選擇。有的一抗只能用于Western blotting，或免疫組化、免疫熒光、免疫沉淀等；甚至表明石蠟切片或冰凍切片。

（3）種屬反應(yīng)性的選擇（species reactivity）。這一點(diǎn)很重要，表明這種抗體可能存在種屬差異，且這種抗體適合檢測哪種種屬動物體內(nèi)的抗原。

（4）種屬來源，一般兔來源的多是多克隆；而小鼠來源的多是單克隆，但也有另外。根據(jù)此來源來選擇相應(yīng)的二抗。

（5）生產(chǎn)廠家的選擇。不同廠家的同一種抗體它的實(shí)際效價(jià)穩(wěn)定是不同的。

2、石蠟切片和冰凍切片的比較？

（1）要求做冰凍切片的不一定能做石蠟切片，這是今天我向一老師請教得出的結(jié)論。因?yàn)樽魇炃衅瑫r(shí)要高溫烤片，可能會破壞組織的抗原性，如果組織的抗原性較穩(wěn)定，則可作石蠟切片；但是要求做石蠟切片的，可作冰凍切片。

（2）冰凍切片的優(yōu)點(diǎn)是能夠較好的保存組織的抗原免疫活性，做免疫組化時(shí)不需抗原修復(fù)這一步。缺點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)易形成冰晶而破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能會使抗原彌散；切片厚度較石蠟的厚，做的片子沒石蠟的漂亮。當(dāng)你買一抗時(shí)，目錄上都寫著做什么樣的切片，如果它寫著只能做冰凍，就不能做石蠟，如寫著兩者都可，那就都能做。

（3）石蠟切片的優(yōu)點(diǎn)可以保持組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，且容易存放在室溫，而冰凍切片比較麻煩，一定要存在-80度的低溫冰箱中，尤其是用來做原位雜交的的切片，為了防止RNA降解，保存一貫很重要。由于石蠟切片可以切到4微米左右，所以原位雜交探針容易滲透到組織中去，容易成功，而且得到的顏色/形態(tài)都較冰凍切片好。

3、在什么情況下使用Triton-X100

（1）Triton X-100化學(xué)名稱為聚乙二醇辛基苯基醚，是一種去污劑。在免疫組織化學(xué)（>10um厚切片） 和免疫細(xì)胞化學(xué)中一般用Triton X-100 作為細(xì)胞通透劑，在膜上打孔。

（2）其作用原理：Triton X-100 可以溶解細(xì)胞膜、細(xì)胞核膜、細(xì)胞器膜上的脂質(zhì)而使抗體及大分子結(jié)構(gòu)的物質(zhì)進(jìn)入胞漿和胞核內(nèi)，故在細(xì)胞免疫組化時(shí)尤為推薦使用，這樣抗體就能順利進(jìn)入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。

（3）Triton X-100既是一種表面活性劑，也有抗氧化作用。

4、封閉血清的選擇原則是什么？

（1）膜上或切片上有剩余的位點(diǎn)可以非特異性吸附抗體，造成后續(xù)結(jié)果的假陽性！

（2）封閉血清一般是和二抗同一來源的，血清中動物自身的抗體，預(yù)先能和組織中有交叉反應(yīng)的位點(diǎn)發(fā)生結(jié)合，否則在后面的步驟中如果和二抗發(fā)生結(jié)合，會造成背景。

（3）也可以用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗來源一致。

5、抗體孵育條件的比較？

（1）一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果*；孵育時(shí)間：這與溫度、抗體濃度有關(guān)，一般37度1-2h，而4度overnight和從冰箱拿出后37度復(fù)溫45min。

（2）二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時(shí)間需要摸索。

6、一抗4度孵育后為什么要進(jìn)行37度復(fù)溫？

（1）一方面，防止切片從4度直接放入PBS易脫片；

（2）另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要，但對表達(dá)較弱的抗原可能有用，4度和37度時(shí)分子運(yùn)動方式不同，前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動速度小于后者，后者結(jié)合更快，但敏感性也提高了并易造成非特異染色。

（3）其實(shí)，我更贊同后一種說法，因?yàn)槲覈L試把肝臟或睪丸片子從4度Overnight拿出后，直接用PBS洗沒發(fā)生過脫片現(xiàn)象。事實(shí)勝于雄辯！

7、DAB顯色時(shí)間如何把握？

（1）DAB顯色時(shí)間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時(shí)間，到出現(xiàn)淺棕色本底時(shí)即可沖洗；

（2）DAB顯色時(shí)間很短（如幾秒或幾十秒）就出現(xiàn)很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時(shí)間過長，需要下調(diào)抗體濃度或縮短你的抗體孵育時(shí)間；

（3）此外，若很短時(shí)間就出現(xiàn)背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時(shí)間；

（4）DAB顯色時(shí)間很長（如超過十幾分鐘）才出現(xiàn)陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵育時(shí)間過短（一抗4度Overnight）；另一方面就是封閉時(shí)間過長。

8、免疫組化結(jié)果如何分析？

（1）陽性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法。在40*光鏡下，隨機(jī)選擇不重疊的10個(gè)視野，人工或機(jī)器計(jì)數(shù)陽性著色細(xì)胞，每組3~6張不同動物組織切片，然后進(jìn)行組間比較即可。

（2）灰密度分析法。通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用image j進(jìn)行灰密度分析，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析即可。

（3）評分法。通過在光學(xué)顯微鏡下對組織切片分別按染色程度（0~3分為陰性著色、淡黃色、淺褐色、深褐色）、陽性范圍進(jìn)行評分（1~4分為 0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），zui終可以分?jǐn)?shù)相加，再進(jìn)行比較。

對于以上這幾種方法，各有利弊，請細(xì)心選擇。要想得到正確結(jié)果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質(zhì)量切片。

9、在什么情況下進(jìn)行組織抗原修復(fù)，抗原修復(fù)的條件是什么？

（1）由于組織中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發(fā)生了蛋白之間交聯(lián)及醛基的封閉作用，從而失去抗原性。通過抗原修復(fù)，使得細(xì)胞內(nèi)抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。

（2）修復(fù)方法從強(qiáng)到弱一般分為三種，高壓修復(fù)、微波修復(fù)、胰酶修復(fù)。修復(fù)液也分為若干種（具體的可以查閱相關(guān)資料，大量的：中性的、高pH的等）。

（3）微波修復(fù)，我們一般用6min*4次，效果不錯(cuò)。

10、內(nèi)源性過氧化物酶的滅活時(shí)間和濃度是什么？

（1）一般3%過氧化氫滅活時(shí)間短點(diǎn)，可以10min左右；而0。3%過氧化氫則可以適當(dāng)延長封閉時(shí)間，一般10~30min。

（2）用甲醇配置過氧化氫比雙蒸水或PBS可能好在保護(hù)抗原和固定組織作用，過氧化氫孵育時(shí)間過長易引起脫片。

（3）現(xiàn)用現(xiàn)配，配好后4度避光保存。

11、如何才能充分脫蠟？

（1）蠟不溶于水，如果脫蠟不干凈，少許蠟存留于切片上，將會引起染色不均勻、陽性物時(shí)隱時(shí)現(xiàn)、真假難辨、背景染色增加等。為了解決上述的問題，切片在染色前必須*脫蠟，目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯，因它脫蠟力強(qiáng)，脫蠟時(shí)間較短；

（2）脫蠟的時(shí)間要根據(jù)季節(jié)，室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天，室溫較高，脫蠟試劑也新鮮，則脫蠟時(shí)間不需很多，3-5分鐘就已足夠。如果在冬天，室溫較低，脫蠟試劑也較陳舊，則脫蠟時(shí)間需要延長，10-20分鐘或更長。

（3）當(dāng)天切的切片，燒烤2小時(shí)后進(jìn)行染色，切片帶有溫度進(jìn)行脫蠟這將可加速脫蠟的過程，如果預(yù)先切好烤好的切片，在染色前，還必須對切片進(jìn)行加溫 10-20分鐘，然后再行脫蠟，這樣脫蠟速度加快，效果魁偉更好。

總之，操作時(shí)應(yīng)根據(jù)不同的季節(jié)，不同的室溫，不同的試劑來決定，脫蠟的時(shí)間，原則上是要*、干凈、*地脫去切片上的蠟。

12、如何zui大限度地降低組織非特異性染色？

（1）縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來控制。這是zui重要的一條。

（2）一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看。

（3）內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高（含血細(xì)胞多的組織），需要通過延長滅活時(shí)間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；

（4）非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時(shí)間和適當(dāng)增加濃度來加強(qiáng)封閉效果；

（5）縮短DAB孵育時(shí)間或降低DAB濃度/過氧化氫濃度等；

（6）適當(dāng)增加PBS沖洗次數(shù)和浸洗時(shí)間，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤為重要；

（7）防止標(biāo)本染色過程中出現(xiàn)干片，這容易增強(qiáng)非特異性著色。

13、蘇木素復(fù)染時(shí)間的把握？

（1）蘇木素復(fù)染時(shí)間要看當(dāng)時(shí)的室溫、溶液的新舊、目標(biāo)抗原的定位等情況，一般數(shù)秒-數(shù)分鐘。不過這個(gè)如果染色不理想可以補(bǔ)救的。即：染色深則分化時(shí)間稍長些即可；染色淺則再置于蘇木素中染色即可。

（2）鹽酸酒精是分化，氨水是返蘭。作用不同。片子復(fù)染完后流水振洗，然后置于鹽酸酒精中數(shù)秒（一定動作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蘭即可。

（3）如果分化的顏色過淺，可以復(fù)置于蘇木素中染色。

14、PBS的清洗方式選擇、次數(shù)和時(shí)間的選擇？

（1）單獨(dú)沖洗，防止交叉反應(yīng)造成污染。

臨床上每天檢測的病例很多，所用的抗體種類及項(xiàng)目也多，如果在加入一抗孵育完后，將它們在一個(gè)缸內(nèi)洗，這樣就會造成交叉污染，影響zui后的結(jié)果。正確的做法是單獨(dú)地進(jìn)行沖洗，沖洗的PBS為一次性，保證切片沒有相互交叉污染的機(jī)會。

（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。

沖洗切片，取出切片，將PBS從上輕輕地沖洗，讓PBS自上而下流下來，不要拿起切片將PBS對準(zhǔn)切片沖洗，這樣由于沖出的PBS有一定的沖擊力，很容易使切片周邊引起松動，導(dǎo)致切片的脫落。

（3）沖洗的時(shí)間要足夠，才能*洗去結(jié)合的物質(zhì)。

沖洗切片有人提出用微振蕩器振染，振下未結(jié)合的各種物，使之不產(chǎn)生背景，此種做法一是浪費(fèi)時(shí)間，二是很容易導(dǎo)致切片的脫落。切片的沖洗據(jù)實(shí)踐認(rèn)為，用一小燒杯柔和地于切片上沖洗，就能*沖洗去未結(jié)合的物質(zhì)，無需附加其它條件，沖洗好于切片上再注入PBS，持續(xù)2分鐘左右就*足夠了。

（4）PBS的PH和離子強(qiáng)度的使用和要求。

中性及弱鹼性條件（PH7-8）有利于免疫復(fù)合物的形成，而酸性條件則有利于分解；低離子強(qiáng)度有利于免疫復(fù)合物的形成，而高離子強(qiáng)度則有利于分解。

（5）常用試劑的配制和使用。

在免疫組織化學(xué)的染色過程中，用得zui多的試劑就是緩沖液，因?yàn)榍衅谡麄€(gè)染色中，抗體的加、換、切片的沖洗，DAB的配制都離不開緩沖液。可見緩沖液在整個(gè)染色中都起至關(guān)鍵的作用，緩沖液的過酸或偏堿，都將影響染色的結(jié)果。

15、脫片產(chǎn)生的原因和如何防止脫片？

（1）多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問題。我原先是買的，邁新按說也是不錯(cuò)的，可是都脫成什么樣子了。后面補(bǔ)做第二批時(shí)用的病理科老師自己做的片子，要好一點(diǎn)。

（2）組織切的不好，切片機(jī)的問題例如比較老的舊的機(jī)器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。

（3）組織的問題，我用的組織癌癥的很多，越是癌癥組織有壞死之類越容易脫。

（4）沒烤好，時(shí)間短溫度不夠之類。

（5）操作的時(shí)候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子不甩或輕輕甩，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水。

（6）修復(fù)的問題：抗原修復(fù)的時(shí)候高壓時(shí)間過長了，或者放進(jìn)100度的修復(fù)液時(shí)手法不好，咚的一聲就丟進(jìn)去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修復(fù)比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時(shí)候也沒辦法，只有從另外的問題上著手。

（7）此外，一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹(jǐn)慎，用PBS的時(shí)候盡量用泡的，不要沖。基本上把這些方面都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。

16、背景染色較深的原因有哪些？

（1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對其工作濃度進(jìn)行測試，使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡單的按說明書進(jìn)行染色。

（2）抗體孵育時(shí)間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘，及時(shí)提醒，避免因遺忘而造成時(shí)間延長。現(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí)，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。

（3）DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長：DAB現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長，因?yàn)樵跊]有酶的情況下，過氧化氫也會游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。不過當(dāng)染色片太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí)，這樣做似乎不現(xiàn)實(shí)，但至少應(yīng)對一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控，避免顯色時(shí)間過長。

（4）組織變干：修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。

（5）切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長（大于24小時(shí)）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實(shí)驗(yàn)室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4？C冰箱Overnight，對結(jié)果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時(shí)間太長。

（6）一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時(shí)設(shè)立陽性對照和用使用過的抗體作比較。

17、蘇木素復(fù)染后氨水返藍(lán)這一步如何做、濃度多少、時(shí)間多長？

答：返藍(lán)可以用堿性溶液（PBS/NA2HPO4/淡氨水）或45度溫水、冷水藍(lán)化均可。一般藍(lán)化5~10 min。淡氨水有人用50ml自來水+三四滴的氫氧化銨。